上海淳麦生物科技有限公司

实验七：感受态菌的制备
1．目的
学会CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞。
2．原理
细菌在0°CCaCl₂低渗溶液中膨胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50mL微量离心管，1.5mL微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。
4．试剂
E. coli DH5a，E. coli BL21（DE3），LB培养基，0.1mol/L CaCl₂溶液，15%甘油-0.1mol/L CaCl₂溶液，无菌dd Water。
5．实验准备
1.5mL离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液（灭菌），冰冷的15%甘油-0.1mol/L CaCl₂溶液（灭菌），无菌dd Water，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。
6．操作步骤
（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mL LB（不含抗菌素！）培养基。
（2）从超低温冰柜中取出DH5a菌种和BL21(DE3)菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mL LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。
（3）取0.5mL上述菌液转接到含有50 mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下25 r/min摇床培养2~3h，测定OD₅₉₀为0.375（<0.4~0.6，细胞数<10⁸/mL，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。
（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。
（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1mL 冰冷的0. mol/L CaCl₂溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。
（6）4℃、5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液垂悬，插入冰中放置30min。
（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液垂悬，超净工作台中按每管100mL分装到1.5mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏。
（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
7．思考题
（1）制作感受太菌的过程中，应注意那些关键步骤？
（2）CaCl₂溶液的作用是什么？

实验八：细菌转化
1．目的
学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。
2．原理
质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5mL微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
4．试剂
LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。
5．实验准备
无菌dd water，1.5mL离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20% IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，）。
6．操作步骤
（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上，37℃、120rpm震荡1h。
（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μL 2% X-gal，7μL 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（9）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
7．思考题
（1）影响转化效率的因素有哪些？
（3）白色菌落出现的原理是什么？

实验九：转化克隆的筛选和鉴定
1．目的
学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。
2．原理
利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。
3．器材
旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5mL 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
4．试剂
LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内切酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO₄，0.025mol/L Tris-Cl pH8.0）。
5．实验准备
无菌dd water，1.5mL离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/mL氨苄青霉素。
6．操作步骤
方法一：酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4 ℃冰箱中。
（4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选取有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片段大小是否与预期相符。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
方法二：快速PCR筛选法
（1）在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在0.2mL PCR 微量离心管中配制25μL反应体系。
     dd water                       16μL
     10 × PCR buffer（不含MgCl₂） 2.5μL
     25 mM MgCl₂1.5μL
     2.5 mmol/L dNTP                2μL（每种dNTP终浓度0.2mM）
     10 μmol/L Primer1               1μL（10 pmoles）
     10 μmol/L primer2               1μL（10 pmoles）
     Taq酶                       0.5μL（1.5u）
     总体积                       25μL
     模板质粒：用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗
（3）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）：
     ①94℃ 5min
②94℃ 1min
③60℃ 1min
④72℃ 1 min50s
⑤go to ② 29times
⑥72℃ 10min
（4）PCR结束后，取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片段同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（5）按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒
（6）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。
7．思考题
（1）PCR法筛选的优点和缺点是什么？
（2）酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？

（3）最终确认克隆的方法有哪些？
DH5α感受态细胞

DH5αλpir感受态细胞

T-O-P--10感受态细胞

TOP-10F`Chemically Competent Cell

Mach1-T1感受态细胞或 T1感受态细胞

JM109感受态细胞，

JM110感受态细胞

XL1-Blue感受态细胞

XL1-Blue MRF`Kan感受态细胞

XL2-Blue感受态细胞

XL10-Gold感受态细胞

DB3.1感受态细胞

B834(DE3)感受态细胞

Stbl2感受态细胞

Stbl3感受态细胞

TG1感受态细胞

HB101感受态细胞

SURE感受态细胞

DH10B感受态细胞

DH10Bac感受态细胞

BJ5183感受态细胞

BJ5183-AD-1感受态细胞

Stable感受态细胞

Turbo感受态细胞

EPI400感受态细胞

EPI300感受态细胞

GT115感受态细胞

MC1061F-感受态细胞

S17-1 λpir感受态细胞

JM330感受态细胞

MG1655感受态细胞

BW25113感受态细胞

细胞荧光标记

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