涨姿势啦！感受态细胞转化效率高，原来都这样做啊！

从事多年的研发实验，平时常常听到客户这样问，为什么我也是用的这个感受态细胞，但转化效率没那么高？今天上海淳麦生物科研者为大家进行详细讲解，教你如何提高感受态细胞转化率。

 

感受态转化效率定义

 

转化效率定义为转化1μl质粒至给定体积的感受态细胞中所能产生的菌落形成单位（cfu）的数量。但是，转化1μl质粒是不常见的。

 

实际上，转化效率常以在最适条件下转化100pg—1ng高纯度超螺旋质粒来计算。

 

计算转化效率（TE）的公式为：

TE=菌落数/μg/稀释度。

 

转化效率计算可以用来做比较细胞或连接效率。下面列出了推荐转化方法和一些技巧以帮助获得实验结果。

 

推荐方案

 

 

一、高效转化方法

1. 冰上解冻细胞

2. 细胞中加入10ng—100ng的质粒DNA（1-5μl），混匀，切忌涡旋

3. 置于冰上30分钟

4. 42热激60秒或根据推荐条件进行热激

5. 置于冰上5分钟

6. 加入900μl室温的SOC

7. 37震荡（250rpm）培养60分钟

8. 混匀细胞，切忌涡旋，并用SOC做10倍梯度稀释

9. 每个稀释比例取50-100μl稀释液涂布于预热的选择平板上，37（SHuffle菌株30）过夜培养或按推荐条件培养

    

 

二、5分钟转化方法

（与上述方法相比只有10%的转化效率）

 

1. 手握解冻细胞

2. 细胞加入10ng—100ng的质粒DNA（1-5μl），混匀，切忌涡旋

3. 置于冰上2分钟

4. 42热激30秒或按推荐方案进行热激

5. 置于冰上2分钟

6. 加入900μl室温的SOC或LB。快速取50-100μl涂布于选择平板上，37过夜培养（SHuffle菌株30）

   注意：使用非氨苄青霉素时，需要37震荡培养

    

转化技巧

 

 

01、解冻

• 细胞在冰上解冻

• 管中的最后一点感受态融化后，立即加入DNA

• 可以手握解冻细胞，但是一旦温度高于0时，转化效率就会下降

• 细胞与DNA冰浴

• 冰浴30分钟。预计每缩短10分钟会降低转化效率2倍

   

 

02、热激

• 温度和时间取决于转化体积和适用的容器，一般为42孵育60秒

   

 

03、生长

• 37生长1小时对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有效果。预计每缩短15分钟会有2倍的转化效率损失

• SOC比LB培养基的转化效率高2倍

• 震荡或旋转晃动试管可使转化效率提高2倍

   

 

04、涂平板

• 选择转化效率不受温度、湿度明显影响的平板

• 温暖而干燥的平板利于涂布，并能快速长出菌落

   

 

05、DNA

• 用于转化的DNA应纯化，并重悬于水中或TE缓冲液中

• 直接从连接产物中取10μl的DNA用于转化，仅有2倍效率损失

• 为实现转化，可通过柱离心或酚抽提和乙醇沉淀的方法纯化DNA

• 最适DNA用量比通常认为的要低，纯化超螺旋pUC19的用量在100pg-1ng之间时转化效率最高。但是，随着DNA用量增加至100ng，单次转化反应中得到的总克隆数也会增多

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